جداسازی و تعیین خصوصیت باکتری بومی مقاوم به فلزات سنگین و حلال های آلی برای کاربردهای بیوتکنولوژی صنعتی

مناطق آلوده به پساب های صنعتی، محیط مناسبی جهت بررسی مکانیسم های منجر به تحمل یا مقاومت در برابر فلزات سنگین و حلال های آلی در سوش های باکتریایی می باشند. این پژوهش در سه بخش با هدف جداسازی و شناسایی سویه ی باکتریایی مقاوم به فلزات سنگین و حلال های آلی، بررسی مکانیسم های مقاومتی سویه و غربال فعالیت آنزیمی صورت گرفت. در این راستا، از خاک و آب در مناطقی که احتمال آلودگی به این آلاینده های سمی می رفت؛ نمونه گیری انجام شد. غربال سویه های مقاوم با استفاده از محیط نوترینت (براث و آگار) و نمک فلزات شامل pb(no3)2، hgcl2، cocl2، cdcl2 و k2cro4 و نیز حلال های آلی تولوئن، گزیلن، بنزن، بوتانول، پروپانول و کلروفرم انجام شد. تعیین mic در حضور فلزات و حلال های مختلف مقاومت بالای سویه ی asm1 نسبت به سایر ایزوله ها را آشکار ساخت؛ به گونه ای که این سویه به ترتیب در حضور غلظت های: 60، 8/0، 4، 5/3 و 9/4 میلی مولار فلزات و 15، 20، 40، 2، 4 و 10 درصد حلال های آلی قادر به رشد بود. شناسایی سویه با روش مولکولی آنالیز ژن 16s rdna نشان داد که سویه بالاترین تشابه را به گونه ها ی b. methylotrpohicus و b. amyloliquefaciens دارد. برای تعیین ساز و کارهای مقاومتی به فلز سنگین راهکارهای متعددی از جمله روش های طیف سنجی و تصویربرداری استفاده شد. سنجش میزان برداشت فلزات سنگین توسط سویه در شرایط in vivo با استفاده از اسپکتروسکپی جذب اتمی نشان داد که حداکثر میزان حذف آلاینده های سرب و کبالت به ترتیب در سرعت هوادهی 100 و 180 دور در دقیقه و دمای ?45 خواهد بود. نتایج حاصل از تکنیک ftir جهت تأیید اتصال فلز به گروه های عاملی سطح سلول نشان داد که گروه هایی مانند هیدروکسیل، آمین، کربوکسیل و فسفات در این اتصال دخیل هستند. همچنین با تکنیک xrd مشخص گردید که در شرایط یکسان، اتصال سرب به گروه های سطحی با ایجاد کریستال های pb6o5(no3)2 همراه است اما اتصال کبالت به سطح به صورت آمورف خواهد بود. از آنجا که سویه ی حاضر به حلال آلی مقاومت نشان داد، غربال فعالیت پروتئازی توسط سویه با استفاده از محیط skm انجام شد. پس از تأیید تولید آنزیم پروتئاز خارج سلولی، بهینه سازی تولید آن انجام شد و نتایج حداکثر تولید آنزیم را در محیط کشت با ترکیب: گلوکز 5/0%، پپتون 75/0%، سولفات منیزیم 7 آبه 5/0%، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 5/0% و سولفات آهن 7 آبه 01/0% با 9ph=، 24 ساعت گرماگذاری در دمای ?37، و شیک دورانی 170 دور در دقیقه تأیید کرد. خالص سازی جزئی آنزیم طی دو مرحله: رسوب عصاره ی خارج سلولی با آمونیوم سولفات تا 80 درصد اشباع و سپس ستون q-sepharose انجام شد. تعیین خصوصیات عصاره ی خارج سلولی دارای فعالیت پروتئولیتیکی نشان داد که آنزیم در دمای ?50 و 10ph= حداکثر فعالیت را دارد. پایداری آنزیم در ph و دماهای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص گردید که آنزیم به ترتیب در محدوده ی دمایی ?55-37 و 11-6ph= به مدت 30 دقیقه پایدار می باشد. نتایج حاصل از بررسی فعالیت و پایداری آنزیم در حضور سورفکتانت ها و حلال های آلی نشان داد که آنزیم در حضور tween 20، ?–mercaptoethanol و حلال های dmso، n-هگزان، متانول و تولوئن بیشترین فعالیت را دارد. گرماگذاری آنزیم در حضور مهارکننده های مختلف مشخص ساخت که فعالیت پروتئولیتیکی در حضور pmsf بطور کامل مهار می شود و به احتمال قوی، آنزیم تولید شده یک سرین پروتئاز می باشد. مطالعات فلورسانس ذاتی حاکی از فشرده شدن ساختار آنزیم در حضور tween 20 و برعکس باز شدن ساختار در حضور گزیلن می باشد.